主要内容
DNA克隆概述
DNA克隆的概念，目的与基础步骤。
要点：
- DNA克隆 是一种分子生物技术，来制作很多完全相同的一段DNA，如一个基因。
- 在一个典型的克隆试验中，一段目标基因被插入叫做 质粒 的环形DNA上。
- 通过转化的过程，质粒将会被带入细菌里，并由抗生素的使用来选择带有质粒的细菌。
- 具有正确质粒的细菌被用来生产更多的质粒DNA，或在某些情况下，被诱导表达这段基因，从而生成蛋白质。
介绍
当你听到“克隆”一词时，你也许会想到整个生物体的克隆，例如克隆羊多莉。然而，其实 克隆 一个东西的全部意思就是制作一个基因上完全相同的复制品。在一个分子生物实验室里，最经常克隆的是一个基因或其他小段DNA。
如果分子生物学家的朋友说她的“克隆”无效，那么几乎可以肯定她是在说复制DNA片段，而不是制造下一个多莉羊！
DNA克隆概述
DNA 克隆 是一个制作多个、相同的一段DNA拷贝的过程。在一个典型的DNA克隆程序中，基因或其他我们感兴趣的DNA（也许是某一个对医学很重要的人类蛋白基因）先是被插入到称为 质粒 的环形DNA当中。插入这一过程是通过一种可以“剪切和粘贴”DNA的酶，这会生产出 重组DNA，也就是由多个来源的片段组成的 DNA 。
其次，重组的质粒被引入细菌。带有质粒的细菌被筛选，继续生长。随着这些细菌的生殖，他们将质粒复制并将其传给后代，从而制作其包含的DNA的拷贝。
制作多个一段DNA序列的多个拷贝有什么用处呢？在有些情况下，我们需要大量DNA拷贝来进行实验或构建新的质粒。在其他情况下，这段DNA编码了一个对我们有用处的蛋白，细菌就被用作为生产蛋白质的“工厂”。例如，人类的胰岛素基因就在 E. coli 细菌被表达，来生产糖尿病患者所需的胰岛素。
DNA克隆的步骤
DNA克隆用于许多目的。例如，让我们来看看DNA克隆是如何被用于在细菌内部合成蛋白质（例如人类胰岛素）的。这些步骤如下：
- 把质粒剪开并“粘贴”上基因。这一过程依赖于限制性内切酶（可以切开DNA）和DNA连接酶（可以连接DNA）。
- 将质粒插入细菌。使用抗生素筛选来识别那些接受了质粒的细菌。
- 培养大量的携带质粒的细菌，并将它们用作“工厂”来生产蛋白质。从细菌中收集蛋白质并提纯。
接下来，咱们来更仔细地看一看每一个步骤。
1. 剪切和粘贴DNA
不同来源的DNA是如何结合在一起的？一种常见方法是使用两种类型的酶：限制性内切酶 和 DNA连接酶。
一个 限制性内切酶 是一种可以切割DNA的酶，它能够识别一个特定目标序列并且在这个位点或它的附近将DNA切成两段。许多限制性内切酶会在切割末端留下短短的、单链的悬垂序列。如果两个分子有匹配的悬垂序列，它们可以碱基配对并且粘在一起。但是，它们不会结合形成一条未间断的 DNA 分子直到它们被 DNA 连接酶连接在一起。DNA 连接酶会把DNA骨干的裂缝粘合好。
我们克隆的目的是将目标基因（例如人类胰岛素基因）插入到一个质粒中。我们用经过仔细选择的限制性内切酶来消化：
- 具有一个切割位点的质粒
- 每一端都包含一个切割位点的目标基因片段
然后，我们将片段与DNA连接酶混合在一起。DNA连接酶会把片段连接起来生成一个含有目标基因的重组质粒。
细菌的转化和筛选
在名为 转化 的进程中，质粒和其他DNA可以被引入像 E. coli 等细菌内部。在转化（ transformation）过程中，特殊准备过的细菌细胞会被(比如用高温)冲击，鼓励它们接收外来DNA。
一个典型的质粒包括一个 抗生素抗性基因，它可以让细菌在特定的抗生素的存在下存活。因此，接收了质粒的细菌可以在一个含有此抗生素的培养皿上被筛选（selected）出来。没有质粒的细菌会死去，而携带质粒的细菌可以生存并且繁殖。每一个生存下来的细菌都会繁殖形成一个小小的、点状菌群，由携带有相同质粒的一模一样的细菌构成。每一个这样的菌群被称为一个“菌落”。
不是所有的菌落都含有正确的质粒。那是因为在连接过程中DNA片段并不总是按我们想要的方式“粘贴”在一起。
我们必须从多个菌落里收集DNA，看看哪一个具有正确的质粒。例如限制性内切酶消化（restriction enzyme digestion）和聚合酶链式反应（ PCR ）都是检查质粒的常用方法。
3. 生产蛋白质
一旦我们发现了一个具有正确质粒的菌落，我们就可以培养很多携带质粒的细菌。然后，我们向细菌发出一种化学信号来指示它们制造目标蛋白质。
细菌就化为微型的“工厂”，很快生产出大量蛋白质。例如，如果我们的质粒含有人类胰岛素基因，细菌就会开始转录基因，翻译mRNA来生产出很多人类胰岛素蛋白分子。
一旦蛋白质被生产出来，细菌细胞就可以裂开将它们释放出来。除了目标蛋白质（如胰岛素）之外，还有许多其他的蛋白质和大分子在细菌外漂浮着。因此，目标蛋白必须 提纯，也就是通过生物化学技术将它与细胞的其他物质分离。纯化后的蛋白可以用于实验，或者，拿胰岛素举例，发放给病人。
DNA克隆的用处
通过克隆技术制造的DNA分子在分子生物学中有许多用处。一个短短的例子包括：
- 生物制药。 DNA克隆可以被用来制造有生物医学应用的人类蛋白质，例如上文提到的胰岛素。其他重组蛋白质的例子包括人类生长激素，提供给无法合成这种激素的病人，还有组织型纤溶酶原激活剂（tPA），用于治疗中风和防止血栓。像这样的重组蛋白通常在细菌中制作。
- 基因治疗。 在一些遗传疾病中，患者缺乏特定基因的运转正常的形式。基因治疗试图向病人身体细胞提供一份正常基因的拷贝。例如，DNA克隆被用来构建含有正常的基因的质粒，来替换囊性纤维化中不正常的版本。当这些质粒被给予给囊性纤维化患者后，他们肺功能恶化的速度降低了
- 基因分析。在基础研究实验室中，生物学家经常使用DNA克隆来建设人工的重组基因，来帮助他们理解正常基因是如何在一个生物体中发挥作用的。
这些只是现在生物学中使用DNA克隆的几个例子。DNA克隆是一种非常常见的技术，用于各种各样的分子生物学应用。